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Pruebas de Identificación

Prueba

Descripción

Resultado

Agar
MacConkey

Es un medio diferencial que permite distinguir entre enterobacterias que hidrolizan lactosa y las que no lo hacen.

La hidrólisis de la lactosa produce ácidos orgánicos y las colonias que la hidrolizan adquieren un color rojo.

Las colonias lactosas negativas permanecen incoloras aunque el medio tira a amarillo por la subida de pH que origina la utilización de las proteínas (peptona) del medio

Se inoculan placas del medio y se incuban a 37 oC

Positivo
Negativo
Sin crecimiento

Agar sangre

Medio de cultivo enriquecido con la adicción de sangre. Las hemolisinas son enzimas que lisan los hematies. Las bacterias que producen estas enzimas presentan un halo transparente alrededor de las colonias a consecuencia de la lisis de los hematies.

Se siembre por agotamiento en estría en placas de agar sangre y se incuba

Hemolisis alfa
Hemolisis beta
Hemolisis gamma
Sin crecimiento
Sin resultados

Beta
galactosidasa

Esta enzima hidoliza la lactosa originando glucosa y galactosa

Se añade un sustrato artificial ortocitrofenial galactósido (ONPG) que hidrolizado por la ß-galatosidasa originandose en color amarillo

Positivo
Negativo

Catalasa

La catalasa es una enzima que proteje a las células frente al peróxido de hidrógeno producido en el metabolismo del oxígeno. Cataliza la formación de agua y oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno.

Es util para distinguir Streptococcus (negativa) de Staphylococcus (positiva) y Clostridium (negativa) de Bacillus (positiva)

La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de hidrógeno sobre las colonias en placa que no sea de agar sangre (daría falsos positivos). La producción de burbujas indica la presencia del enzima.

Positivo
Negativo

Citrato

Es uno de los test del IMVIC usado para diferenciar enterobacterias. el crecimiento consume el ácido y como consecuencia se produce un incremento de pH en el medio y el indicador tira de verde a azul.

El citrato es la única fuente de carbono y se realiza sembrando la bacteria en la superficie de un agar de Simmon's inclinando el tubo

Positivo
Negativo

Coagulasa

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. Los Staphylococcus aureus patógenos dan una reacción postiva y los no patógenos negativa

Se añade una suspensión densa de bacterias a un tubo pequeña con plasma y se incuba a 37 oC. Se observa la coagulación a las 4 y 24 h sin sacarlos de la estufa.

Positivo
Negativo

Contraste
de fases

El microscopio de contraste de fases es un sistema en el que se acentúa la diferencia del índice de refracción entre las células y el medio incrementando así el contraste en células translúcidas sin uso de colorantes.

Bacilos
Cocos

Descarboxilasa
de aminoácidos

Los aminóacidos al perder el grupo carboxilo convierten en aminas que incrementan el pH del medio y el indicador (púrpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas son útiles en la diferenciación de enterobacterias.

Las bacterias se inoculan en medios complejos que contienen lisina, ornitina o arginina al 1% y un indicador de pH (púrpura de bromocresol)

Positivo
Negativo

DNasa

Algunas bacterias excretan nucleasas que despolimerizan el DNA

Se hace una estría gruesa una placa conteniendo DNA. Se revela después de incubar con HCL 0,1 N que precipita el DNA no hidrolizado.

Positivo
Negativo

Esporas
(calentamiento)

Las Endosporas son formadas por Bacillus y Clostridium. Son Formas de resistencia, metabolicamnete inactivas que resisten la alta temperatura, la desecación y la radiación.

Las endosporas pueden sobrevivir al calentamiento y originan nuevas formas vegetativas en un medio de cultivo.

Se inocula un tubo de caldo con una suspensión sospechosa de contener endosporas.

Se calienta a 80 oC durante 10 min.

Se enfría y se incuba a temperatura adecuada.

Positivo
Negativo

Fenilalanina desaminasa

Las desaminasas catalizan la pérdida de NH3 en un aminoácido originando un ácido carboxílico

Se incolulan tubos inclinados conteniendo un medio complejo y fenilalanina. Después de la incubación se añade una solución de cloruro férrico.

Positivo
Negativo

Fermentación
de azucares

Las bacterias anaerobias o anaerobicas facultativas a menudo fermentan carbohidratos a ácidos orgánicos y gas (H2 o CO2). Estos pueden detectarse incluyendo en el medio un indicador de pH y una campana Durham. Se pueden ensayar diferentes azúcares como sustrato para diferenciar especies sobre todo bacterias entéricas.

Se inocula la bacteria en un medio conteniendo una pequeña cantidad de peptona, un indicador de pH y una fuente de carbono fermentable al 1-2 % y se coloca dentro de los tubos una campana Durham.

Acido
Acido + gas
Negativo
Sin ácido

Gram

La tinción de Gram es la más importante de las tinciones diferenciales. Las células Gram positivas retienen el cristal violeta cuando se tratan con etanol mientras que las gram negativas no lo tienen y se tiñen entonces del color rojo de la safranina.

Diferencias en la estructura de la pared son las responsables de este comportamiento.

Se tiñe con cristal violeta

Se trata con lugol como mordiente

Se decolora con etanol 96o

Se añade safranina como colorante de contraste

Bacilos Gram-negativos
Bacilos Gram-positivos
Cocos Gram-positivos Cocos Gram-negativos

Hidrólisis
de Esculina

La esculina contiene un carbohidrato unido a un compuesto aromático. Este test se usa a menudo para distinguir especies de Streptococcus.

Se crecen las bacterias en un medio complejo que contiene 0,01 % de esculina y un 0,05 de citrato férrico.

Positivo
Negativo

Hidrólisis
de gelatina

La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de las células. Las bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polímeros transportando al interior de la célula en monómeros que les sirven para crecer.

La producción de proteasas es evaluada por incorporación de una proteína (gelatina o caseína) en un medio sólido en placa. La placa se inunda con ácido que precipita la proteina no hidrolizada.

Positivo
Negativo

Hidrólisis
de lípidos

Algunas bacterias excretan lipasas extracelulares que pueden hidrolizar lípidos grandes en sustratos de bajo peso molecular que son trasportados al interior de la célula para ser utilizados en el crecimiento.

Una emulsión de lípidos y un indicador llamado Spirit Blue se incorporan en un medio sólido complejo.

Positivo
Negativo

Hidrólisis
del almidon

Los polisacaridos, como el almidón son demasiados largos para ser transportados al interior de la célula. Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos polímeros hasta oligo o monosacáridos que pueden usarse como sustratos para crecer.

La hidrólisis de almidón es analizada en medios conteniendo almidón en placa. Después de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el almidón intacto forma un complejo púrpura.

Positivo
Negativo

Hidrólisis
del hipurato

El hipurato es un compuesto orgánico aromático que puede ser hidrolizado enzimáticamente originando benzoato y glicina. Este test se usa a menudo para diferenciar especies de Streptococcus.

Una suspensión de bacterias se añade a una solución de hipurato y se incuba 2 horas. En ese momento se añade la nihidrina.

Positivo
Negativo

Indol

Uno de los test del IMVIC utilizado para diferenciar enterobacterias.

Existen bacterias que producen triptofanasa que convierte el triptófano en indol

La bacteria se crece en medios que contienen triptófano (caldo de triptoma). La presencia de indol se ensaya añadiendo dimetilaminobenzaldehído.

Positivo
Negativo

Inhibición
por KCN

El KCN inhibe la cadena de transporte de electrones uniéndose a los citocromos impidiendo el crecimiento microbiano. Sin embargo, algunas bacterias no son inactivadas y pueden nacer.

Las bacterias se inoculan en caldo de peptona que contiene cianuro potásico.

Sensible
Resistente

Motilidad

La movilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos. El movimiento puede observarse en preparación en fresco con el microscopio de contraste de fase

Para ver la movilidad se realiza una preparación en fresco que se observa en contraste de fases.

La movilidad debe distinguirse del movimiento Browniano debido a las corrientes en la preparación.

Movil
Inmovil

O-F
(oxidación
-fermentación)

En condiciones aerobias las bacterias pueden oxidar la glucosa hasta CO2 gas. El oxígeno es el aceptor final de e- en el metabolismo respiratorio. en condiciones anaerobicas en ausencia de un aceptor de e- como nitrato, las bacterias sólo pueden utilizar la glucosa por vía fermentativa. En este test se evalúa la capacidad de las bacterias para oxidar y/o fermentar produciendo ácido que se detecta gracias al azul de bromotinol (indicador de pH) Es útil en la distinción de pseudomonas y enterobacterias.

Se inoculan tubos de medio con asas de punta recta. Uno de los tubos se recubre con aceite de parafina para aislarlo del oxígeno (tubo de fermentación) y otro no (tubo de oxidación)

Fermentativo
Oxidativo
Negativo

Oxidasa

La presencia de citocromo C oxidasa en la cadena de trasporte de e- puede detectarse utilizando un aceptor de e- artificial p-fenilendiamina. Este test se usa para diferenciar pseudomonas (positivo) de enterobacterias (negativo)

Se impregnan discos de papel con parafenilandiamina y se coloca en un cultivo creciendo en placas de agar nutritivo.

Positivo
Negativo

Producción
de sulfhídrico

Muchas bacterias producen sulfuro de hidrógeno a partir de aminoácidos azufrados (cisteína o metionina) o tiosulfato.

La fermentación de sulfhídrico puede ser detectada incluyendo hierro reducido en el medio para formar un precipitado negro de FeS

Se inocula un medio de agar nutritivo conteniendo tiosulfato metionina y sulfato ferroso.

Positivo
Negativo

Reducción
de nitrato

Algunas bacteris pueden usar nitratos como aceptor final de e- en la respiración. el nitrato puede ser reducido a nitrito o en un paso más a gases (óxidos de nitrógeno). Las enterobacterias y pseudomonas son usualmente positivos.

Las bacterias se inoculan en medios conteniendo nitrato potásico. El nitrito procedente de la reducción de células puede detectarse añadiendo alfanalfilamina y ácido sulfanílico produciendose un color rojo. Se puede saber si el nitrato puede haberse reducido a más que a nitritos produciendose gas. Si al añadir zinc en polvo no hay color rojo es que no hay nitrato porque se ha reducido a gas (desnitrificación)

Positivo
Negativo

Rojo de
metilo

Es uno de los test del IMVIC para bacterias entéricas. Algunas vias fermentativas originan ácidos orgánicos mientras otras originan productos que son neutros.

Las bacterias se crecen en caldo de glucosaçpeptona. Si se fermenta el azúcar el pH baja por debajo de 4.3.

Se añade rojo de metilo como indicar que es rojo a pH <4.3. y amarillo a pH >4.3.

Positivo
Negativo

Tioglicolato

Este medio se usa para determinar el efecto del oxígeno sobre el crecimiento microbiano. Un tubo con medio semisólido contiene tioglicolato para reducir el potencial redox del medio. Así sólo hay oxígeno en la superficie y no en el resto del tubo. Un indicador redox, resazurina, indica si hay oxígeno (rojo) o no (incoloro).

El tubo es inoculado con un asa de punta y se incuba hasta que se produce su crecimiento.

Aerobio
Anaerobio
Facultativo
Microaerobio

Ureasa

Este enzima hidroliza la urea (H2N-CO-NH2) y origina amonio lo que producirá un incremento del pH que puede detectarse con un indicador.

Las bacterias se inoculan en un medio con glucosa-peptona y urea al 2%. Como indicador de pH se utiliza rojo fenol

Positivo
Negativo

Utilización
Fuentes de Carbono

La mayoría, pero no todas las bacterias pueden crecer en medios simples con una única fuente de carbono. Este método permite ensayar tal habilidad y la capacidad para utilizar sustratos específicos.

Las bacterias se inoculan en medios simples conteniendo diferentes sustratos orgánicos como fuentes de cargono y energía.

Positivo
Negativo

Voges-
Proskauer

Uno de los test del IMVIC para enterobacterias es el Voges Proskauer. Las especies que llevan a caso fermentación a butanodiol de la glucosa acumulan acetoína en el medio.

Las bacterias se inoculan en caldo glucosa-peptona. Las especies que llevan a cabo la fermentación butanodiólica de la glucosa aumentean acetoína en el medio.

Se añade alfanaftol en medio alcalino (KOH). La acetoina se convierte en diacetilo que reacciona formandose un color rojo

Positivo
Negativo

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